Figlio primogenito di Cosimo I ed Eleonora di Toledo nacque il 25 marzo 1541, fu il secondo Granduca di Toscana dal 1564 alla morte, avvenuta improvvisamente e misteriosamente nel 1587.
Nel 1564 ricevette il titolo di reggente conferitogli dal padre Cosimo I e l’anno successivo sposò Giovanna d'Austria, figlia di Ferdinando I d'Asburgo e sorella dell'imperatore Massimiliano II, il matrimonio più prestigioso mai celebrato dalla famiglia Medici.
Nel 1574 alla morte di Cosimo I, che nel frattempo aveva ottenuto dal papa il titolo di granduca, Francesco salì sul trono, mantendendo il carattere descritto dai diplomatici del tempo, taciturno e malinconico, fortemente legato alla propria sfera privata a dispetto della vita pubblica. Francesco sposò in seconde nozze nel 1578 la nobildonna veneziana Bianca Cappello. La nuova moglie di Francesco, anche se visse molto appartata dalla vita pubblica.
Lontano per indole dalla politica, Francesco preferì delegare gli affari di governo ai ministri per soggiornare lunghi periodi fuori città nelle residenze di campagna, in particolare nella Villa di Poggio a Caiano. Qui Francesco e Bianca vi morirono il 19 ottobre del 1587 dopo giorni di atroce agonia, a poche ore di distanza.
La sera dell'8 ottobre 1587, dopo una giornata trascorsa in battuta di caccia insieme al fratello Ferdinando, Francesco I e Bianca cenarono presso la Villa di Poggio a Caiano, ma, prima Francesco e poi Bianca, si sentirono male e si misero presto a letto accusando febbre elevata e intermittente con episodi di vomito: undici giorni dopo erano morti entrambi, senza che l'uno sapesse dell'altra.
La morte fu attribuita dai contemporanei ad un attacco di malaria, una malattia molto diffusa nei secoli passati. Tuttavia fin da subito si sparsero voci che la coppia fosse stata avvelenata da Ferdinando del quale era nota l'avversione per Bianca e che ambiva a succedere al fratello prima che questi generasse un erede maschio. Ferdinando da parte sua contribuì ad alimentare i sospetti creando una barriera di segretezza intorno alle due salme e assumendosi in prima persona la gestione diretta dell'avvenimento. Fece eseguire un'autopsia su entrambe e in modo apparentemente frettoloso ne dispose la sepoltura.
L'improvvisa e non chiarita morte dei due personaggi ha alimentato, nei secoli successivi, il fiorire di ipotesi e ricostruzioni, oltre a fornire l'ispirazione per opere letterarie.
Tuttavia, un'indagine portata a conclusione nel 2006 da un'équipe di studiosi dell'Università di Firenze, guidati dal tossicoilogo forense Francesco Mari, anche grazie al ritrovamento delle anfore contenenti i resti delle viscere di Bianca Cappello, ha condotto alla conclusione che l'avvelenamento da arsenico sia la più probabile causa della morte della coppia granducale. Anche tale conclusione, però, è stata quasi subito messa in dubbio da un altro gruppo di studiosi delle università di Pisa e Torino, guidati dallo storico della medicina Gino Fornaciari, secondo il quale le cause del decesso andrebbero invece effettivamente fatte risalire alla malaria.
